Ứng dụng Kỹ thuật Real Time PCR đa mồi trong chẩn đoán căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương

Nhiễm trùng huyết trẻ em là một nguyên nhân gây tử vong thường gặp ở các đơn vị hồi sức tại các nước đang phát triển. Tuy nhiên việc xác định căn nguyên gây bệnh bằng cấy máu truyền thống cho tỷ lệ phát hiện thấp do việc sử dụng kháng sinh của các bệnh nhân trước khi đến điều trị tại bệnh viện.

 

                                                        Nhóm tác giả: Phùng Thị Bích Thủy^1,2, Khúc Thị Rềnh Hoa¹, Phan Thu Chung^1,2, Tạ Anh Tuấn¹, Nguyễn Thanh Liêm^1,2

¹ Khoa Nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Nhi trung ương

² Viện Nghiên cứu sức khỏe trẻ em

Tóm tắt

Đặt vấn đề: nhiễm trùng huyết trẻ em là một nguyên nhân gây tử vong thường gặp ở các đơn vị hồi sức tại các nước đang phát triển. Tuy nhiên việc xác định căn nguyên gây bệnh bằng cấy máu truyền thống cho tỷ lệ phát hiện thấp do việc sử dụng kháng sinh của các bệnh nhân trước khi đến điều trị tại bệnh viện. Mục tiêu: Áp dụng phương pháp sinh học phân tử real time PCR đa mồi trong chẩn đoán căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng huyết tại bệnh viện nhi trung ương. Phương pháp: nghiên cứu cắt ngang phân tích 30 trẻ từ 1 tháng đến 15 tuổi  điều trị tại khoa hồi sức cấp cứu, Bệnh viện Nhi trung ương với chẩn đóan nhiễm trùng huyết, xác định bằng phương pháp cấy máu và real time PCR đa mồi, trong khỏang thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2012. Kết quả:  Áp dụng phương pháp real time PCR đa mồi phát hiện được 43,3% dương tính trong khi phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3% tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết. Các ác nhân nhiễm trùng huyết thường gặp nhất là Klebsiella pneumonia/oxytoca có tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp sau là Enterobacter cloacae/ aerogenes        với 2 trường hợp (6,6%), thêm vào đó là các vi khuẩn và nấm khác như: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia.

Kết luận: Áp dụng kỹ thuật real time PCR đa mồi trong chẩn đoán nhiễm trùng huyết cho thấy độ nhạy, độ dặc hiệu cao đồng thời rút ngắn thời gian hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống

ABSTRACT

Apply multiplex real time PCR to diagnosis children septicemia  in National Hospital of Pediatrics

Background: Children septicemia is a common cause of death in intensive care units in developing countries. However, determination of caused disease by blood culture was not effectively because using antibiotic of patients before they admitted hospital. Aims: apply multiplex real time PCR to diagnosis pathogen which caused septicemia id children in National Hospital of Peadiatric. Method: Analysis 30 children who from 1 month to 15 year old admitted Intensive care unit, NHP. Blood culture and multiplex real time PCR were using during from Jan to June, 2012. Result: Using multiplex real time PCR detected 43.3% positive patients but 3.3% detected by blood culture. The most common causal agent of children sepsis was Klebsiella sp. (23.3%), followed by Enterobacter sp. (6.6%) and other Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia. Conclussion: Apply multipleax real time PCR method to diagnosis of pathogens which caused children septicemia have sensitive, specific and short time better than blood culture

Đặt vấn đề

Nhiễm trùng huyết, sốc nhiễm trùng huyết và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những tập hợp bệnh lý rất thường gặp trong lâm sàng và đặc biệt nhất là trong các đơn vị hồi sức. Nhiễm khuẩn huyết là nguyên nhân gây tử vong cao ở bệnh nhân, theo số liệu công bố tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng huyết là 5,9 trong tổng số 100.000 trẻ, trong số đó tỷ lệ tử vong ở trẻ từ 1-4 tuổi là 0,6/100.000 và 0,2/100.000 ở trẻ từ 5-14 tuổi [1]. Chỉ riêng ở Hoa kỳ thì mỗi năm có khoảng 750.000 mắc bệnh trong số đó 215.000 trường hợp tử vong, chiếm 9,3% tổng số tử vong tại đất nước này. Như vậy, đứng về số lượng thì tử vong do nhiễm trùng huyết tương đương với tử vong do nhồi máu cơ tim cấp và cao hơn nhiều so với AIDS và ung thư vú. Thời gian nằm viện trung bình là 19.6 ngày và chi phí điều trị cho mỗi trường hợp là 22. 100 USD tức là khoảng 16,7 tỷ USD nếu tính trên toàn Hoa Kỳ [2]. Mặc dù có nhiều tiến bộ vượt bậc trong hiểu biết cơ chế sinh lý bệnh của nhiễm trùng huyết cũng như sự phát triển của các phương pháp chẩn đoán điều trị song tỷ lệ bệnh nhân mắc và tử vong vì nhiễm trùng huyết trên thế giới vẫn không ngừng ra tăng và chiếm tỷ lệ không nhỏ.

Cấy máu là phương pháp phổ biến và vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng “gold standard” trong chẩn đoán và xác định các căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng huyết như vi khuẩn và nấm. Thông thường cấy máu được thực hiện trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh. Tuy nhiên phương pháp cấy máu thường có độ nhạy thấp đối với các bệnh nhân trước đó đã sử dụng thuốc kháng sinh hoặc đối với những loại vi khuẩn phát triển chậm hoặc có sự tạp nhiễm.

Việc điều trị kháng sinh sớm cho thấy hiệu quả lớn tới kết quả điều trị đầu ra của bệnh nhân. Người ta tính rằng trung bình với mỗi 1h chậm điều trị kháng sinh thì trung bình giảm 8% khả năng sống sót của các bệnh nhân [3]. Khi mà các vi sinh vật sinh trưởng chậm được nghi ngờ, quá trình điều trị được tiến hành trước khi có kết quả cấy máu, vì vậy việc phát hiện nhanh các tác nhân gây nhiễm trùng  sẽ cho phép điều trị kháng sinh đúng, nhanh dẫn tới làm giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân.

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy máu thông thường đồng thời đáp ứng nhu cầu điều trị của bệnh nhân, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng phương pháp real time PCR đa mồi (SeptiFast) để chẩn đoán nhiễm các tác nhân gây nhiễm trùng huyết.  Kỹ thuật real time PCR có độ nhậy cao hơn và thời gian cho kết quả ngắn hơn, đồng thời nó còn có khả năng phát hiện được cùng một lúc nhiều loại tác nhân gây bệnh so với phương pháp cấy máu thông thường. Sử dụng kỹ thuật real time PCR được xem là phương pháp ưu việt vì có thể chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh mà phương pháp cấy máu cho kết quả âm tính do bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước khi cấy máu.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật real time PCR đa mồi trong chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết tại bệnh viện Nhi trung ương” nhằm tìm ra phương pháp tối ưu nhất để điều trị kịp thời cho bệnh nhi góp phẩn nâng cao hiệu quả điều trị tại bệnh viện Nhi trung ương.

Đối tượng và phương pháp

Trong nghiên cứu này chúng tôi thu thập bệnh phẩm của 30 bệnh nhi có độ tuổi dưới 15 tuổi được điều trị tại khoa Hồi sức cấp cứu, có dấu hiệu của nhiễm trùng huyết khi nhập Viện trong thời gian từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 6 năm 2012.

Mẫu bệnh phẩm được thu thập là 2ml máu có chống đông EDTA của bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm được thu nhận ngay khi bệnh nhân nhập viện và cùng thời điểm lấy mẫu cấy máu và làm công thức máu.

Sau khi mẫu được thu thập, tiến hành tách chiết RNA/DNA tổng số trên hệ thống máy tách chiết tự động Mag NA Pure LC 2.0 (Roche) sau đó tiến hành real time PCR đa mồi (SeptiFast, Roche).

Phương pháp nghiên cứu thực hiện theo nghiên cứu cắt ngang,

Kết quả

Trong nghiên cứu của chúng tôi thu thập của 30 bệnh nhi tại khoa  Hồi sức cấp cứu có chẩn đoán nhiễm trùng huyết, sử dụng chẩn đoán theo kỹ thuật real time PCR đa mồi để phát hiện 25 căn nguyên vi khuẩn bao gồm: vi khuẩn gram (-): Escherichia coli, Klebsiella (pneumonia/oxytoca), Serratia marcescens, Enterobacter (cloacae/ aerogenes), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia,  vi khuẩn gram (+): Staphylococcus aureus, CoNS (Coagulase negative Staphylococci- S.epidermldls, S. haemolyticus), Streptococcus pneumonia, Streptococcus spp (S.pyogenes, S.agalactiae, S.mitis), Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis) và các chủng nấm: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata, Aspergillus fumigatu. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi tiến hành thu thập mẫu cùng thời điểm của cấy máu và real time PCR đa mồi như sau:

Bảng 1: Tỷ lệ phát hiện các căn nguyên nhiễm khuẩn huyết theo hai phương pháp realtime PCR đa môi và nuôi cấy.

	Real time PCR	Nuôi cấy
Dương tính	13 (43,3%)	1 (3,3%)
Âm tính	17 (56,7%)	29 (96,7%)

Kết quả cho thấy, trong tổng số 30 mẫu có chẩn đoán nhiễm trùng huyết thu nhận được tiến hành xét nghiệm chẩn đoán bằng phương pháp real time PCR đa mồi và nuôi cấy máu truyền thống  như sau: với kỹ thuật real time PCR đa mồi phát hiện được 13 trường hợp dương tinh (phân loại ở bảng 2) chiếm 43,3% trong khi đó với phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 01 trường hợp dương tính chiếm 3,3%, kết quả này cũng trùng hợp với kết quả chạy real time PCR  đa mồi. Bên cạnh đó không phát hiện được căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết với 17 trường hợp bằng real time PCR đa mồi chiếm 56,7% còn đối với phương pháp nuôi cấy truyền thống không phát hiện được ở 29 trường hợp chiếm 96,7%.

Trong các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết Klebsiella pneumonia/oxytoca có tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp sau là Enterobacter cloacae/ aerogenes               với 2 trường hợp (6,6%), thêm vào đó là các vi khuẩn và nấm khác như: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia.

Bảng 2: Các căn nguyên gây bệnh nhiễm trùng huyết được phát hiện ở hai xét nghiệm real time PCR đa mồi và nuôi cấy máu truyền thống

Real time PCR	Nuôi cấy
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Candida parapsilosis Aspergillus fumigatu Candida albicans Enterobacter cloacae/ aerogenes (02) Klebsiella pneumonia/oxytoca (07) Escherichia coli Stenotrophomonas maltophilia	Pseudomonas aeruginosa Candida parapsilosis

Trong các nhóm 13 mẫu dương tính khi chay real time PCR đa mồi có 8 trường hợp tử vong và 05 trường hợp ổn định lại bình thường.

Thảo luận

Qua nghiên cứu của chúng tôi về ứng dụng phương pháp real time PCR đa mồi trong chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em cho thấy tỷ lệ phát hiện là 43,3% trong khi phát hiện bằng phương pháp cấy máu truyền thống chỉ đạt được 3,3%. Điều này có thể do ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh đại trà trước khi bệnh nhân được đến bệnh viện điều trị, việc sử dụng kháng sinh trước khi vào viện sẽ ảnh hưởng rất nhiều tới kết quả nuôi cấy gây ức chế chính vi vậy hầu hết các kết quả cấy mấu đề cho âm tính và không phát hiện được căn nguyên gây nhiễm trùng huyết. Việc ứng dụng phương pháp real time PCR đa mồi lần đầu tiên được sử dụng tại Việt nam nhằm xác đinh các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết đem lại hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Sự so sánh và đánh giá ban đầu về độ nhậy và khả năng chẩn đoán cũng như thời gian cho kết quả của kỹ thuật real time PCR so với phương pháp cấy máu đã được công bố trong nhiều nghiên cứu gần đây. Theo một nghiên cứu của L.E.Lehmann năm 2009 so sánh tỷ lệ  về độ đặc hiệu của kỹ thuật real time PCR và phương pháp cấy máu thông thường trên 18 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm trùng huyết cho thấy tỷ lệ dương tính của PCR là 0,81 và của cấy máu là 0,64 [4].

Theo Epharaim L. Tsalik năm 2009 tiến hành so sánh giữa phương pháp PCR đa mồi và phương pháp cấy máu thông thường trên cùng một số đối tượng bệnh nhân cũng cho kết quả rất khả quan là 0.64 % và 0.60 %. Ngoài ra PCR còn phát hiện được 24 trường hợp dương tính mà cấy máu đã cho kết quả âm tính. Sau đó nhà nghiên cứu kết luận real time PCR có tiềm năng để thay thế cho phương pháp cấy máu thông thường [5]

Tại Việt Nam nhiễm trùng huyết là tình trạng nhiễm khuẩn nặng và gây tử vong rất cao đặc biệt là ở trẻ em. Nhiễm khuẩn huyết cũng là nguyên nhân gây bệnh cảnh lâm sàng nặng nề cho bệnh nhân, làm tăng chi phí điều trị, kéo dài thời gian nằm viện đồng thời làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện. Nhiễm khuẩn huyết ở trẻ em trong giai đoạn sớm có triệu chứng không rõ ràng nhưng bệnh tiến triển rất nhanh và có nhiều biến chứng nguy hiểm như sốc nhiễm trùng, rối loạn chức năng đa cơ quan để lại di chứng nặng nề và dẫn tới gây tử vong cho bệnh nhân.

Ở trẻ em đặc biệt là các trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ sức đề kháng yếu, trẻ không thể uống thuốc theo đường miệng khi điều trị trẻ phải chịu nhiều các thủ thuật xâm lấn như tiêm, truyền vì vậy việc xác định nhiễm khuẩn huyết sớm sẽ làm giảm tỷ lệ tử vong cho các bệnh nhân. Số liệu thống kê của Viện Bảo Vệ Sức Khỏe Trẻ Em Việt Nam cho thấy nhiễm trùng huyết sơ sinh có tỉ lệ tử vong đứng hàng thứ hai sau hội chứng suy hô hấp sơ sinh.

Theo một nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi đồng 1 thì có tới 45 % bệnh nhân nhiễm trùng huyết là trẻ sơ sinh và tác nhân gây bệnh phổ biến là S. coag.negative (28.33%), Klebsiella sp. (20%), Acinetobacter sp. (20%), tiếp đó là E.coli và một số tác nhân khác [6].

Theo một nghiên cứu cắt ngang tại đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh phân tích 130 trẻ sơ sinh dưới 1 tháng tuổi điều trị tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 với chẩn đóan nhiễm trùng huyết sơ sinh dựa trên kết quả cấy máu dương tính cho thấy tác nhân gây bệnh nhiễm thường gặp nhất là Klebsiella sp. (36,9%), tiếp đến là Staphylococcus sp.(26,9%) và Acinetobacter sp. (10,8%) [7].

Theo Nguyễn Thanh Liêm và cộng sự tiến hành nghiên cứu trên 204 bệnh nhi sơ sinh được chẩn đoán nhiễm trùng huyết cũng  chỉ ra tác nhân gây bệnh phổ biện là các vi khuẩn Gram âm (chiếm 61.3%) trong đó dẫn đầu là Klebsiella spp (44%), E.coli (19%). Các vi khuẩn Gram dương chiếm tỷ lệ thấp hơn như Staphylococcus coagulase negative và một số vi khuẩn khác [8]. Điều đáng quan tâm là hầu hết các vi khuẩn này đã kháng với các loại kháng sinh ban đầu do vậy việc điều trị cho bệnh nhân là hết sức khó khăn.

Hiện tại phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết tại hầu hết các bệnh viện trong nước kể cả tại bệnh viện Nhi Trung ương chủ yếu dựa vào cấy máu truyền thống. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trước khi bệnh nhân đến điều trị tại bệnh viện là một hạn chế lớn trong việc chẩn đoán căn nguyên gây bệnh bằng cấy máu. Bên cạnh đó, đối với những bệnh nhi nhỏ tuổi hoặc trẻ sơ sinh việc quyết định có sử dụng kháng sinh hay không có ý nghĩa rất quan trọng vì nếu lạm dụng kháng sinh hoặc điều trị kháng sinh không phù hợp sẽ dẫn đến hậu quả rất nghiêm trọng gây ảnh hưởng tới hiệu quả điều trị. Đó chính là lý do giải thích tại sao cần phải tiến hành chẩn đoán sớm nhiễm khuẩn huyết theo phương pháp real time PCR.

Phương pháp realtime PCR sử dụng trên thế giới để chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết đáp ứng được yêu cầu về thời gian (có kết quả sau 24h), đồng thời kỹ thuật realtime PCR cho kết quả chính xác với độ nhậy cao hơn so với kỹ thuật cấy máu thông thường, khả năng phát hiện được các tác nhân gây bệnh nhiều hơn. Việc sử dụng phương pháp real time PCR (SeptiFast kit) có thể phát hiện được 25 tác nhân vi khuẩn và nấm gây bệnh và đặc biệt bộ kit này có độ nhạy và đặc hiệu cao đối với những chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến tại Việt Nam.

Kết luận

Áp dụng qui trình, ứng dụng kỹ thuật realtime PCR chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết tại Bệnh Viện Nhi Trung ương cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao bên cạnh đó rút ngắn được thời gian chẩn đoán so với phương pháp cây máu truyền thống. chính vi vậy sử dụng phương pháp này là hết sức cần thiết góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong của trẻ em trong quá trình điều trị bệnh nhân nhiễm trùng huyết tại bệnh viện.

Tài liệu tham khảo

1. Stephen M. Schexnayder (1999). Pediatric Septic Shock. Pediatr. Rev.;20;303-308.
2. Augus DC, Linde-Zwirbe WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR. (2001) Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med.; 29: 1303-1310.
3. Nguyễn Ngọc Rạng (2001), “Nhiễm khuẩn huyết sơ sinh: các yếu tố tiên lượng và liệu pháp kháng sinh”, Thời sự Y dược học,(10), tr. 258 – 261.
4. L.E. Lehmann, K.P. Hunfeld, M. Steinbrucker, V. Brade, M. Book, H. Seifert, T. Bingold, A. Hoeft, H. Wissing, F. Stüber (2009). Improved detection of blood stream pathogens by real-time PCR in severe sepsis. Intensive Care Med. 1:49-56.
5. Ephraim L. Tsalik, Daphne Jones, Bradly Nicholson, Lynette Waring, Oliver Liesenfeld, Lawrence P. Park, et al. (2010). Multiplex PCR To Diagnose Bloodstream Infections in Patients Admitted from the Emergency Department with Sepsis J. Clin. Microbiol., 48(1):26.
6. Hoàng Trọng Kim, Trương Thi Hòa, Đỗ Văn Dũng ( 2005),  Những yếu tố tiên lượng nặng trong nhiễm trùng huyết tại khoa hồi sức cấp cứu bệnh viện nhi đồng . Y học thành phố HCM, tập 9, số 1, 7-16.
7. Võ Tăng Duyên, Bùi Quốc Thắng (2009), Các yếu tố dịch tễ học, lâm sàng và cận lâm sàng liên quan đến tử vong do nhiễm trùng huyết sơ sinh. Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 – Supplement of No 1: 35 – 39
8. Nguyễn Thanh Liêm (2004), Đặc điểm lâm sàng, vi trùng học ở trẻ sơ sinh sanh non bị nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Nhi Đồng từ 1/1999 đến 1/2004, Luận án chuyên khoa II, Trường Đại học Y Dược TP HCM.